In-vitro в Українському хмелярстві: панацея?

Про саджанці хмелю

Посадковий матеріал хмелю та його виробництво

За часів Радянського Союзу, відтворення еліти хмелю, до 1964 р., було епізодичною роботою, яку робили лише зацікавлені селекціонери. Враховуючи важливість збереження і розмноження сортів у виробництві, необхідність сортооновлення та сортозаміни, у 1964 р. започаткували державне сортовипробування хмелю, а згодом вперше було порушено питання про організацію розсадництва цієї культури.

Але створити розвинену систему розсадництва хмелю вдалося лише після 1979 р., коли Інститут сілького господарства Полісся (ІСГП УААН) були розроблені рекомендації з організації та технології вирощування саджанців хмелю в системі розсадницьких господарств. Це сприяло великомасштабному виробництву садивного матеріалу.

Кращим і головним посадковим матеріалом хмелю для закладання нових і ремонту існуючих плантацій є однорічні саджанці. Вегетативні частини маточної рослини—стеблові, кореневищні і зелені живці, етіольовані паростки та зелені пагони використовуються як первинний матеріал для вирощування саджанців. Технічні вимоги до посадкового матеріалу визначаються галузевими стандартами.

Використання різних вегетативних органів рослин дає можливість в десятки разів збільшити коефіцієнт розмноження будь-якого сорту. Різні способи вирощування посадкового матеріалу описані в методичних рекомендаціях по вирощуванню однорічних саджанців хмелю. Головні з них — вирощування саджанців в шкілках,обладнаних шпалерою, безшпалерний спосіб вирощування саджанців із застосуванням механізації і вирощування саджанців в поліетиленових пакетах із закритою кореневою системою —широко застосовуються у виробництві.

Перспектива виробництва посадкового матеріалу полягає у його вирощуванні на промисловій основі. Промислове розсадництво хмелю — це вирощування посадкового матеріалу в спеціалізованих господарствах або їх підрозділах на основі досягнень науки та передового досвіду. Вирощування таким шляхом саджанців вищих категорій— потужний резерв інтенсифікації хмелярства.

Ситуація, що склалась після розпаду Радянського Союзу та розвалу системи розсадництва хмелю, як ніколи викликала гостру потребу в садивному матеріалі, особливо нових перспективних сортів. Для швидкого впровадження таких сортів у виробництво, саджанців вирощених  традиційними способами було замало. Саме тоді на арену і вийшов «відносно новий» спосіб розмноження саджанців хмелю – in vitro.

Культивування зародків запліднення in vitro

Основними завданнями практично будь-якої селекційної програми є розширення діапазону генетичної мінливості з метою добору або введення бажаних ознак для поліпшення вирощуваних сортів сільськогосподарських культур.

Метод вирощування ізольованих зародків на штучних живильних середовищах (ембріокультура) започаткований у 1904 р. Ханнігом. Культивування in vitro зародків передбачає вирощування їх на спеціально підібраних середовищах в асептичних умовах, попередньо ізольованих із дозрілого (нормального) насіння, з недозрілого насіння (на ранніх стадіях розвитку). У першому випадку зародки повністю диференційовані, у другому — вони знаходяться у різних фазах розвитку.

Практичне значення культури ізольованих зародків із дозрілого насіння полягає у прискореному отриманні рослин з насіння, що погано або зовсім не проростає, а також у виведенні зародка із стану спокою, що починається ще під час дозрівання насіння на рослині.

Найважливішою вимогою при роботі з ізольованими зародками є вибір живильного середовища, здатного підтримувати їх ріст і розвиток. Незважаючи на те, що склад живильних середовищ змінюється залежно від виду культивованих зародків, очевидно, що чим молодший зародок, тим вищі вимоги до складу живильних середовищ. Наприклад, якщо відносно зрілі зародки можна вирощувати на середовищах тільки з додаванням солей і сахарози, то для нормального розвитку зародків, ізольованих на ранніх стадіях, необхідні вітаміни, амінокислоти, фітогормони, а також складні комплексні добавки у вигляді екстракту дріжджів, гідролізату казеїну, кокосового молока тощо. Рекомендується також додавання манітолу й інших компонентів, що забезпечують оптимальний осмотичний тиск, необхідний для правильного розвитку ембріона. Отримані гібридні рослини дорощують в умовах теплиць.

Метод культивування незрілих зародків застосовують більш ніж для 70 видів рослин. Ембріокультури широко використовують у селекції плодових. Особливо вони ефективні в селекції ранньостиглих сортів, коли плоди дозрівають раніше часу, потрібного для нормального розвитку зародка. Подальша селекційна робота з такими сортами залучає метод ембріокультури.

Мікроклональне розмноження та оздоровлення рослин

    Вивчення експериментального морфогенезу іn vitro на всіх рівнях організації (від окремої клітини до верхівки пагона) привело до створення технології мікроклонального розмноження рослин, що здебільшого уже став комерційним.    

    Термін «клон» (від грец. — паросток, пагін) був запропонований Вебером у 1903 р. Для вегетативно розмножуваних рослин. Передбачається, що пагони рослини, яка розмножується нестатевим шляхом, не є індивідуальними в звичайному розумінні слова. Вони лише частини (клони) материнської особини, ідентичні їй і між собою.

    Отже, мікроклональне розмноження — це використання техніки іn vitro для швидкого нестатевого одержання рослин, ідентичних вихідній. Перевагами мікроклонального розмноження рослин порівняно із традиційними методами є: значно вищі коефіцієнти розмноження, що за розрахунками досягають 10⁵ – 10⁶ клонів за рік, тоді як традиційно за цей самий термін від однієї рослини одержують 5—100; мініатюризація, що економить площі, зайняті маточними і розмножуваними рослинами; оздоровлення вихідного садивного матеріалу від нематод, бактерій, вірусів (у разі використання як первинних експлантів меристем стебла, калюсних ліній).

    Значною перевагою технології є і те, що в умовах in vitro часто укорінюються ті рослини, які зовсім не розмножуються або погано розмножуються звичайним способом.

    Важливо і те, що садивний матеріал, отриманий цим способом, генетично ідентичний вихідній рослині, оскільки утворюється з меристемних соматичних клітин рослин.

    Основні етапи мікроклонального розмноження

    По своїй суті, мікроклональне розмноження аналогічне вегетативному типу розмноження рослин, з тією лише різницею, що воно відбувається в пробірці в умовах іп vitro , де з клітин, ізольованих тканин можна одержати досить велику кількість нових рослин. Обов'язковою умовою мікроклонального розмноження є ідентичність отриманого рослинного матеріалу вихідній материнській рослині. Ще недавно цей метод розглядали як можливість прискореного клонування видів рослин, що розмножуються вегетативно, а також як допоміжний метод оздоровлення рослин від вірусів. Проте результати деяких експериментів показали, що значення цього методу істотно зростає для клонової селекції рослин, що вегетативне розмножуються (експериментальний мутагенез і розхимерювання), кріозбереження цінного вихідного матеріалу й особливо вивчення індивідуальної генетики культур, що розмножуються насінням.

    Спроможність утворювати велику кількість (декілька мільйонів і більше) соматичних зародків в умовах іп vitro , що розглядається як один із шляхів практичного використання методу мікроклонального розмноження, застосовується для розробки технології безперервного одержання штучного насіння. Це може перетворити гетерозисну селекцію деяких сільськогосподарських культур на більш ефективнішу і цілеспрямованішу. Більш того, метод мікроклонального розмноження успішно використовується у процесі створення синтетичних сортів.

    На сьогодні кількість видів, що можна клонувати у пробірці, становить понад 1 тис. Більш ніж для 100 видів цей метод знаходить  комерційне застосування.

    Серед них — декоративні, плодово-ягідні, технічні, деревні й інші види рослин.

    Основна перевага методу мікроклонального розмноження порівняно з іншими класичними методами — у вищому коефіцієнті розмноження. Якщо звичайним способом (живцями, цибулинами, кореневищами) від однієї рослини можна одержати 10—100 рослин за рік, то методом мікроклонального розмноження їх число (залежно від виду) можна збільшити від 50 тис. до 1 млн. Отже, для забезпечення необхідного обсягу рослин будь-якої селекційної програми можуть бути використані одиничні і суперелітні рослини. У цьому полягає висока економічність методу. Мільйони рослин можуть вирощуватись на невеликій лабораторній площі (150—200 м 2 ), з меншими затратами електроенергії і праці. У разі використанні методу мікроклонального розмноження існує можливість оздоровлення рослин від вірусів і інших патогенів. Крім того, можливе клонування іп vitro таких культур, як цибулинні, деревні, овочеві та ін. , що важко розмножуються вегетативне класичними методами.

    Фактори, що впливають на прогрес мікроклонального розмноження

           Невеликий розмір експланта для мікроклонального розмноження, його поверхнева стерилізація, асептичне перенесення на живильне середовище і субкультивування в умовах, що виключають інфікування, оздоровлюють отримані рослини від нематод, грибних і бактеріальних патогенів. Однак цього недостатньо для оздоровлення мікроклонально розмноженого садивного матеріалу від вірусів, віроїдів, мікоплазм. Саме вірусні хвороби є причиною втрати від 10 до 50 % врожаю сільськогосподарських культур, що розмножуються вегетативно. Більш того, відомо, що соя, цукрові буряки і деякі інші важливі рослинні культури передають віруси нащадкам під час насінного розмноження, тобто сорти поступово накопичують вірусні інфекції.

    Одержання стійких до вірусів сортів гібридизацією із стійкими дикими видами рослин — шлях довгий, особливо якщо потрібно перенести поріг стійкості до кількох найбільш хвороботворних вірусів. За допомогою генної інженерії це завдання полегшується.

    Створення безвірусного садивного матеріалу багатьох сільськогосподарських рослин залишається актуальним завданням клітинної біотехнології. На сьогодні найефективніший для досягнення цієї мети засіб — культивування меристем стебла або органів стеблового походження, які, як правило, вільні від фіто- та ентомопатогенів. У деяких випадках метод культури меристем доповнюють термотерапією.

    Фахівці з культури тканин і клітин уже давно навчилися вирощувати рослини з апікальної меристеми, що складається з конуса наростання й одного або двох листкових зачатків. Можна створити умови і для одержання рослини з тканини тільки конуса наростання без листкових зачатків. Проте чим більший розмір меристемного експланта, тобто чим більше листкових зачатків і тканини стебла він має, тим краще йде прогрес морфогенезу, що закінчується одержанням цілої, нормальної пробіркової рослини. Водночас зона, вільна від вірусних часточок, дуже різноманітна для різних вірусів. Це залежить також від виду і сорту рослини.

    Метод мікроклонального розмноження посідає важливе місце у прискореному клонуванні. Вперше цей метод успішно застосував французький дослідник Ж. Морель у 1960 р. для розмноження орхідеї ( Cymbidius ). З одного вихідного експланта йому вдалося протягом року одержати близько 4 млн. нових рослин, вільних від вірусної інфекції.

    Позитивні результати одержано у разі використання цього методу для вегетативне розмножуваних рослин. Для деяких видів (особливо декоративних) метод клонального мікророзмноження іn vitro ефективний з комерційного погляду. Для інших видів рослин він застосовується з метою створення елітного і суперелітного матеріалу.

    Практично кожен вид рослини може бути розмножений в умовах іn vitrо. Слід зазначити, що все ж таки основною проблемою за широкого використання методу мікроклонального розмноження для деяких видів рослин залишається висока вартість отриманих клонів.

    Метод мікроклонального розмноження має значення для оздоровлення вихідного рослинного матеріалу. Загальновідомо, що боротьба з вірусними хворобами багатьох сільськогосподарських культур — одна із найактуальніших проблем рослинництва в усьому світі, тому що з виробництва можуть зникати цінні сорти рослин. Особливо гострою є ця проблема для вегетативно розмножуваних багаторічних культур.    

    Крім методу культури меристем одержати здоровий садивний матеріал можна і шляхом регенерації рослин із калюсних, суспензійних і протопластних культур, в яких віруси, як правило, не розмножуються. Однією з важливих умов одержання безвірусного садивного матеріалу є на явність надійних методів тестування вірусів. У минулому використовували щеплення, електронно-мікроскопічні дослідження листків і соку чутливих до вірусів рослин-господарів, а також різноманітні тести. Пізніше були розроблені точніші методи: ЕLISА (е nzyme linked immunosorbent assay) та імунна електронна мікроскопія. Проте найчутливішими методами, що дають змогу діагностувати не лише вірусні, а й віроїдні патогени, є методи моноклональних антитіл і ДНК-зондів .   

    Розмноження цінних генотипів

    Для деяких видів рослин застосування традиційних методів селекції ускладнене через тривалість життєвого циклу, високий рівень гетерозиготності, труднощі статевого розмноження. Тому можливість клонування таких генотипів іn vitrо значно полегшує їх селекцію і розмноження.

     У нашій країні розвиваються лабораторії мікроклонального розмноження, пов'язані з потребами селекції, а також ті, що є початком ланцюжка насінництва картоплі на безвірусній основі. Проте у деяких випадках для нашої країни могли б становити інтерес суто комерційні фірми-лабораторії. Їх створенню має передувати прогнозування рентабельності і соціальної необхідності виробництва цього виду продукції (садивного матеріалу). Вартість продукції, ринкова ціна, ємність ринку, сезонність постачання, вибір видів і сортів рослин — усі ці чинники визначаються перед схваленням рішення про організацію комерційних госпрозрахункових лабораторій.

    Технології мікророзмноження безперервно поліпшують. Їх основні недоліки — значна трудомісткість і високі витрати. Проте для автоматизації і взагалі для зменшення затрат праці, матеріалів, енергії та інших ресурсів потрібна розробка принципово нових прийомів. Серед них можна назвати відмову від укорінення рослин іn vitro і застосування для цього техніки гідро-й аеропоніки іn vitro , регуляцію і стимулювання процесів морфогенезу короткими світловими імпульсами різного спектрального складу, застосування полімерів, що регулюють водопостачання рослини відповідно до потреби.

Підвищення рентабельності виробництва клонально розмноженого, оздоровленного матеріалу іn vitro має ресурси в збільшенні коефіцієнта розмноження, відсотка укорінених мериклонів, швидкості роботи операторів. Надалі прогресс пов'язаний з автоматизацією і роботизацією трудомістких процедур. Вартість праці навіть у рентабельних виробництвах становить 41 % загальних витрат. Перехід до автоматизації можливий за розуміння, що розмножуваний матеріал — це майбутня рослина, і, застосовуючи всі маніпуляції, слід надавати матеріалу стандартних розмірів, форм, кольору, що може розрізнити електроніка автомата при виконанні заданої програми. Можна припустити, що технології вирощування меристем, мікроклонів у суспензіях, рідкому живильному середовищі легко автоматизуються.

    Багатообіцяючими є технології використання соматичного ембріоїдогенезу для одержання штучного насіння, які проводять у багатьох лабораторіях світу.

    Невирішених біологічних і технічних проблем багато, одна з них — створення модулюючих умов, за яких соматичні ембріоїди не будуть або, навпаки, будуть мати генетичні варіації порівняно з прототипом.

    У розроблюваних для потреб сільського господарства біотехнологіях багато емпірики. Це неминуче поки немає глибокого знання сутності біологічних процесів, властивих клітинним і тканинним системам. Необхідно об'єднати знання, отримані на основі молекулярної генетики і генної інженерії, із знаннями фізіології рослин про регуляції процесів росту і розвитку вищих рослин на рівні клітини, тканини, органа. Тільки така інтеграція зусиль може призвести до створення принципово нових, ефективних і рентабельних клітинних технологій, що будуть використані для вирішення проблем сільського господарства.    

In-vitro в промисловості: перші результати.

Перші саджанці хмелю, вирощені методом іn-vitro, були висаджені у плантації в 2004 році. Кількість саджанців, вирощених при дотриманні традиційної технології (тобто з живців, зелених пагонів) перевищує кількість саджанців вирощених методом іn-vitro. Хоча треба відмітити, що у 2008 році ця кількість зросла майжу в 4 рази, у порівнянні з 2007 роком. На даний час в Україні налічується близько 200 га хмеленасаджень, закладеними саджанцями іn-vitro, переважно сорту Національний.     

            Якщо ж казати про урожайність рослин хмелю, вирощених традиційним способом та з застосуванням технології іn vitro, то тут результати не так вже й різняться.

Прикладом може служити ПАФ «Дружба», Черняхівського району, Житомирської області, де урожайність рослин хмелю, вирощених з живців та з саджанців іn vitro, майже однакова. А річ у тому, що рослини хмелю, вирощені з живців, отримали оптимальні умови при закладці та догляду за ними.

Чомусь розвинена думка, що посадивши саджанці, вирощені методом іn vitro, можна зложити руки на «пузі» і до осені про хміль забути, і зібрати багатий врожай. Але такі саджанці дадуть ефект тільки при наявності повної захищеності від хвороб та шкідників, при забезпеченні оптимальних умов росту і розвитку. Бо навіть саджанець іn vitro без зазначених умов дуже скоро втратить свою «безвірусність» та рослинний потенціал. До речі, саджанці, вирощені з зелених пагонів також безвірусні та мало випадають, як і саджанці іn-vitro, але їх собівартість удвічі менша. Виходячи з того, що з 1 га маточника можна отримати до 60 тис.шт. зелених пагонів та при приживлюваності 50 %, маємо 30 тис.шт. саджанців, які майже нічим від іn-vitro не відрізняються.

 У погоні за надприбутками, на гребені використання модного вислова «іn vitro» усі забули, що це лише один зі способів вирощування садивного матеріалу…